在研究蛋白互作的實驗中，蛋白樣本製備的質量對後續western blot或質譜分析影響頗深。

蛋白樣本的製備質量，並不僅(jin) 限於(yu) 蛋白提取，後續可能需要進行的蛋白濃縮、標簽蛋白純化也是樣本製備的關(guan) 鍵操作，每一樣都馬虎不得。

裂解除雜：打破細胞壁壘，提純蛋白的

“清道夫"法則

我們(men) 先從(cong) 蛋白提取說起。傳(chuan) 統的細胞樣本提取蛋白，再到後續的western blot結果分析是比較簡單的，但如果你的樣本是表達重組蛋白的菌體(ti) ，那麽(me) 在使用RIPA裂解後，有時我們(men) 會(hui) 發現裂解物比較黏稠，再接著往下做直到western blot結果出來後可能會(hui) 看到一些莫名其妙的條帶拖尾。

這時，我們(men) 的第一反應可能是：哎呀，樣本要麽(me) 有雜質要麽(me) 降解了。

如果是雜質，那這雜質到底是啥？知其然才能確保下次不出問題。其實，這裏可能是因為(wei) 大量表達重組蛋白的菌體(ti) ，在裂解後會(hui) 釋放出很多染色體(ti) DNA——這就是裂解物黏稠的來源，它在後續的電泳中影響蛋白移動，最終造成顯影結果呈現拖尾。

我們(men) 可以通過3個(ge) 小辦法來改善：一是改用針對不同物種樣品而優(you) 化配方的裂解液，其本質是優(you) 化了去汙劑配方，讓細胞裂解效率更高的同時保持生物活性，第二，在改善裂解液的基礎上，配合超聲同步處理樣本，超聲產(chan) 生的剪切力可以切斷染色體(ti) 長鏈DNA；三是在裂解時再搭配核酸酶除核酸，通常核酸酶是需要單獨加入的，有的核酸酶定向切割DNA，有的則不區分核酸種類，直接把核酸降解為(wei) 幾個(ge) bp長度的小片段。

超濾濃縮：精準把控蛋白濃度，濃縮過程中的

“節流"與(yu) “開源"

選擇合適的樣品除雜方法可以提高結果的質量。但有時蛋白少得可憐，別說雜質了，目的條帶都不一定能看到——比如讓當我們(men) 要研究分泌型的蛋白時。

研究分泌型蛋白，要從(cong) 培養(yang) 物上清獲蛋白。細胞什麽(me) 時間周期進行分泌？是否采用了合適的誘導方法促進分泌？有時，即便已經采用了合適的方法獲得蛋白，但濃度卻不一定能滿足下遊的IP分析。這時，就要考慮蛋白濃縮。

選擇超濾濃縮還是凍幹濃縮更合理？凍幹濃縮的效果可能更好，但是凍幹過程有可能造成蛋白的穩定性破壞，進而影響IP實驗的抗體(ti) 結合效率，而且凍幹後的蛋白還需要考慮複溶的條件，操作複雜，還需要專(zhuan) 門的設備。相比之下，通過超濾濃縮更適合處理分泌型蛋白含量低的問題。

超濾濃縮前，我們(men) 特別應該關(guan) 注2個(ge) 細節：樣品前處理和選擇合適的超濾管。

第一，應該先通過4℃，10,000×g離心去除上清中的大體(ti) 積雜質和細胞碎片。

第二，選擇合適的超濾管，這裏的合適不僅(jin) 包括截留分子量，還包括了濾膜材質。截留分子量大小應該約為(wei) 如果我們(men) 研究的蛋白大小的1/3甚至更低，比如30 kDa的蛋白，就應該選擇10 kDa的超濾管。而濾膜材質的選擇，更多的應該從(cong) 化學兼容性以及對蛋白吸附效果兩(liang) 點出發考慮。這裏建議同學們(men) 通過產(chan) 品說明書(shu) 上提供的化學兼容性表查詢確認即可，而對於(yu) 分泌型蛋白，應該優(you) 先選用低蛋白吸附的再生纖維素膜材質的超濾管，這樣可以避免本就少得可憐的蛋白的二次流失。

標簽融合表達：給蛋白裝上“導航儀(yi) "，

讓分離純化事半功倍

如果你的研究特別超前或小眾(zhong) ——比如要做Co-IP卻發現待測蛋白居然找不到合適的商用抗體(ti) 。那麽(me) ，接下來的樣本製備思路可能對你有啟發。

首先，我們(men) 必須意識到，Co-IP下遊檢測不一定依賴Western blot實驗技術，蛋白互作沉澱後通過SDS-PAGE電泳分離條帶，再利用LC-MS/MS分析互作蛋白，也可以確認待測蛋白信息。這個(ge) 過程不需要抗體(ti) ，它主要依賴足夠的蛋白量以及可供燃燒的實驗室經費。

另外一種思路則是構建標簽表達載體(ti) ，將待測蛋白的基因克隆到含有標簽的表達載體(ti) 中，轉染至目標細胞，並過表達帶上標簽的待測蛋白。進入Co-IP階段後，用已知蛋白的IP抗體(ti) 來做免疫沉澱，Western blot階段再使用標簽抗體(ti) 檢測目標蛋白。

通過融合標簽實現間接檢測是一種比較經濟的做法，我們(men) 需要關(guan) 注的點主要是實驗設計，包括：選擇合適的標簽和設計合理對照。

常見的標簽有FLAG、GST、His、Myc、HA等，如果下遊實驗是Co-IP/IP，建議大家優(you) 先考慮FLAG標簽，因為(wei) FLAG標簽較短、對蛋白空間構象的影響較小，——盡量降低外部標簽對蛋白的折疊、活性以及相互作用的幹擾。

其次，就是設計合理對照，因為(wei) 過表達帶標簽的待測蛋白後，細胞可能無法完成大量外源蛋白的正確折疊，導致蛋白出現異常聚集，這些異常的蛋白就可能無法參與(yu) 蛋白互作。因此，控製轉染的質粒總量、設置多個(ge) 轉染梯度的對照實驗是有必要的。