總有機碳（TOC）分析

總有機碳（TOC）分析為(wei) 製藥行業(ye) 的清潔驗證提供了一種快速、高效的分析方法。在製藥生產(chan) 設施中，當一台設備用於(yu) 加工不同的活性藥物成分（API）時，必須將產(chan) 品之間的交叉汙染降至低限度。清潔驗證是一個(ge) 確保設備清潔流程，並將產(chan) 品和清潔劑殘留去除到預定可接受水平的整體(ti) 過程，符合法規21 CFR 211.67。該條款規定：“設備和器具應在適當的時間間隔進行清潔、維護和消毒，以防止出現故障或汙染，避免藥品的安全性、特性、規格、質量或純度超出標準的規定範圍" 。

01實驗-開發清潔驗證過程

在清潔驗證程序開發過程中，關(guan) 鍵目標是工藝驗證：通過分析數據證明該過程的每一步都能將產(chan) 品和清潔劑殘留去除到預定的可接受水平。美國食品藥品監督管理局（FDA）1993 年的指南要求任何驗收標準都必須 “具有科學依據" 。這些標準會(hui) 因所采用的清潔程序類型（例如在線清潔（CIP）或離線清潔（COP）），以及清潔程序是在同一產(chan) 品的不同批次之間進行還是在更換產(chan) 品類型時進行而有所不同。了解用戶所測試的分析物和清潔劑殘留的類型（例如蛋白質發酵液樣品和陽離子表麵活性劑）也很重要。這些參數決(jue) 定了驗證程序的檢測方法。

TOC 分析正迅速成為(wei) 清潔驗證分析方法，原因如下：許多製藥公司都在采用基於(yu) 全產(chan) 品方法開發清潔驗證方法，即確定是否存在任何殘留，而不考慮其來源（包括產(chan) 品、清潔劑、化學品、溶劑、副產(chan) 品、降解物和微生物汙染物等）。這種方法與(yu) TOC 分析配合良好，因為(wei) TOC 分析能夠檢測分子結構中含碳的任何 API 或清潔劑殘留。詹金斯（Jenkins）等人發現 TOC 分析在清潔驗證中的應用得到了有力支持：“TOC 檢測限低、分析時間短、與(yu) 其他方法相比成本較低，並且能夠檢測所有含碳殘留物" 。通過對比 TOC 分析、高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法、分光光度法（UV）、酶聯免疫吸附測定法、電泳法、pH 值檢測、電導率檢測和目視分析法，他們(men) 發現 TOC 分析的性能與(yu) HPLC 和分光光度法相當，甚至更優(you) 。

越來越依賴 TOC 分析的其他原因還包括：

初始資金投入、運行和維護成本相對較低

操作簡便

靈敏度高

難降解分析物的回收率高

幹擾小

02方法

在開發階段，使用一種或多種能夠代表實際清潔驗證過程中遇到的活性劑類型的模型化合物對分析技術進行測試，以此展示該技術的穩健性、準確性和精密度。

1牛血清白蛋白

牛血清白蛋白（BSA）是一種可以很好地模擬其他蛋白質類、難氧化 API 的化合物。血清白蛋白是所有哺乳動物血漿中常見的一種蛋白質，也是為(wei) 人熟知且經過深入研究的蛋白質之一。通過核磁共振（HNMR）和 X 射線晶體(ti) 學分析，BSA 大致呈心形，含有 607 個(ge) 氨基酸殘基，分子量約為(wei) 66317.25 原子質量單位（amu） 。BSA 本身作為(wei) 活性劑在製藥行業(ye) 中應用廣泛，同時也是開發穩健的清潔驗證分析方法的理想模型化合物。蛋白質很難被氧化，當使用蛋白質化合物作為(wei) 測試劑開發 TOC 檢測方法時，對於(yu) 與(yu) 其他活性劑和抗氧化性較弱的分析物相關(guan) 的分析結果，人們(men) 可以給予高度信任。

2儀(yi) 器設備

實驗目的是使用 BSA 作為(wei) 模型化合物，確定 TOC 分析儀(yi) 的線性響應範圍，以便開發清潔驗證方法，應用賽萊默旗下品牌 OI Analytical Aurora 1030W TOC 分析儀(yi) 和 1088 自動進樣器（圖 1）。

圖1：OI Analytical Aurora 1030W TOC 分析儀(yi)

03測試結果

1校準曲線

實驗使用的校準曲線（圖 2）展示了 Aurora 1030W TOC 分析儀(yi) 在較寬的碳濃度範圍內(nei) 進行高精度校準的能力。該儀(yi) 器使用 KHP 進行校準，KHP 是一種廣泛使用且易於(yu) 氧化的標準物質。圖 2 中的校準曲線由 PC 軟件生成，該軟件與(yu) Aurora 1030W 配備的觸摸屏軟件相同。響應因子表示儀(yi) 器以每 1000 個(ge) 麵積計數中 μg C 為(wei) 單位的響應值。

圖 2：Aurora 1030W TOC分析儀(yi) 的KHP校準曲線

2測試結果

以確定 1030W TOC 分析儀(yi) 對 BSA 的線性響應範圍為(wei) 目標。這一概念與(yu) 儀(yi) 器校準類似，能夠揭示儀(yi) 器對 BSA 濃度呈線性響應的工作範圍。測試結果在圖 3 中以每個(ge) 樣品的 BSA 濃度與(yu) TOC 分析儀(yi) 的麵積計數響應值的關(guan) 係圖呈現。數據顯示，Aurora 1030W 能夠分析濃度約為(wei) 0.5 - 20ppm 的 BSA。

圖3：BSA 濃度與(yu) TOC 麵積計數關(guan) 係圖

作為(wei) 一種難氧化的蛋白質，BSA 在其他研究中顯示出回收率低和儀(yi) 器響應不佳的問題。但這些數據表明，加熱過硫酸鹽氧化技術能夠在較寬的工作範圍內(nei) 消解 BSA 樣品中的碳，並實現回收。如果繪製的圖采用二階最佳擬合曲線，則表明儀(yi) 器對 BSA 的回收不完。在這些情況下，數據通常代表分析儀(yi) 消解 BSA 的穩健性上限；隨著樣品濃度的增加，儀(yi) 器響應相對保持不變。

下表進一步展示了 Aurora 1030W 在分析 BSA 等蛋白質樣品時可達到的精密度和準確度。在分析時，製備了已知濃度的 BSA 樣品。由此可以計算出理論碳濃度，並與(yu) 測量得到的碳濃度進行比較。根據 BSA 的分子量 66317.25amu 和碳的質量百分比 53.065%，可以通過以下公式將碳濃度與(yu) BSA 濃度關(guan) 聯起來：

數據顯示，加熱過硫酸鹽技術能夠以高精度（平均相對標準偏差為(wei) 2.5%）和高準確度（平均回收率為(wei) 87%）分析 BSA 樣品。

在清潔驗證中，確定碳的適當回收率至關(guan) 重要。為(wei) 了準確評估係統回收率，必須確定理論濃度與(yu) 實際濃度的斜率。在圖 4 中，繪製了表 2 中測定的 BSA 回收率，並得出了斜率。

圖4：BSA碳回收

由於(yu) BSA 中理論碳含量預期為(wei) 53.065%，我們(men) 可以根據以下公式計算實際碳含量：
理論濃度/直線斜率=實際濃度
對於(yu) BSA，53.065/1.1317=46.8896%碳。

通過了解分析儀(yi) 的回收率，就可以為(wei) 未來測定未知樣品中 BSA 含量的實驗確定合適的範圍。

04總結與(yu) 結論

開發一套完整的清潔驗證方法是一項龐大而細致的工作，用於(yu) 檢測殘留的分析方法隻是其中的一小部分。本研究使用 BSA 作為(wei) 特征明確的模型分析物，它代表了製藥行業(ye) 中最難氧化的化合物之一。實驗表明 Aurora 1030 TOC 分析儀(yi) 非常適合用於(yu) 在線清潔和離線清潔樣品的實驗室分析。

Aurora 1030W 采用的加熱過硫酸鹽氧化技術和非色散紅外（NDIR）檢測技術，再結合符合21 CFR Part 11要求的軟件以及內(nei) 置報告生成程序等功能，為(wei) 製藥行業(ye) 提供了一款分析人員可以高度信賴的用於(yu) 清潔驗證測試的 TOC 分析儀(yi) 。